Estudio del ADN Secuenciación automática de ADN por la Dra. Gemma Rodríguez Tarduchy y María Concepción Santiago Martínez Servicio de Secuenciación automática de ADN Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIB - CSIC)

• Introducción
• Secuenciación de ADN
  • Métodos clásicos de secuenciación
  • Secuenciación automática
  • Equipamiento
• Aplicaciones de la secuenciación de ADN
• Bibliografía
• El Servicio de Secuenciación automática de ADN

INTRODUCCIÓN

La estructura de la doble hélice del ADN fue descrita por James Watson y Francis Crick en 1953. Dicho descubrimiento ha supuesto un hito en la historia de la biología y su modelo propuesto ha sido ampliamente confirmado.

Según este modelo, la molécula de ADN está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos con polaridad opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido está formado por un azúcar: la desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser de cuatro tipos diferentes: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T) y un grupo fosfato.

Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando larguísimas cadenas . La estructura fosfato-pentosa recorre el esqueleto de la hélice, mientras que las bases se disponen formando un ángulo recto con el eje de la misma.

Las dos cadenas de polinucleótidos que constituyen una molécula de ADN se mantienen unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas (dos puentes de hidrógeno entre A y T, y tres puentes de hidrógeno entre G y C)

La estructura de un determinado ADN está definida por la ordenación o "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de polinucleótidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN.

La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado (A-T; G-C), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas determina automáticamente el orden de la otra, por ello se dice que las cadenas son complementarias.

SECUENCIACIÓN DE ADN

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• Métodos clásicos de secuenciación
  • Método químico de Maxam y Gilbert
  • Método enzimático de Sanger

• Secuenciación automática empleando el método enzimático
  • Secuenciación con cebadores fluorescentes
  • Secuenciación con terminadores fluorescentes
• Secuenciadores automáticos
  • Secuenciadores capilares
  • Secuenciadores en geles desnaturalizantes
• Equipamiento
  • Secuenciador en geles ABI 377
    • Modo operativo: Preparación de las muestras.
• Otros métodos de secuenciación automática de ADN
  • Secuenciación de ADN empleando microarrays
  • Pirosecuenciación

A finales de los años 70 se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple y rápida, determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de ADN. Estos primeros intentos de secuenciar ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta relativamente sencillo para proteínas donde estas resultan de la combinación de hasta 20 aminoácidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes.

En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, o PCR. Esta técnica ha invadido de tal forma la Biología Molecular, que hoy en día es muy difícil imaginar esta ciencia sin ella. En 1989, Science seleccionó el PCR como el principal desarrollo científico, y la Taq polimerasa como la molécula del año. En 1993, Kary Mullis recibió por este descubrimiento el Premio Nobel de Química.

Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya no es una limitación en la investigación en Biología Molecular, ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio del ADN. El número de aplicaciones de esta técnica parecen infinitas, y continúan creciendo sin parar. Una de sus posibles aplicaciones se centra en la secuenciación del ADN de muestras biológicas.

MÉTODOS CLÁSICOS DE SECUENCIACIÓN

Los dos protocolos clásicos de secuenciación (método químico y enzimático) comparten etapas comunes.

• Marcado: Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente
• Separación: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas cuyos tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas de distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud varía en un único nucleótido.

Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:

• Método químico de Maxam y Gilbert

  Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en 1977.

  Esta técnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por electroforésis, en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas.

   

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• Método enzimático de Sanger

  Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson también en 1977 y se conoce como método de los terminadores de cadena o dideoxi.

  Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.

   

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO

Es una alternativa al método de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia. Los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforésis al pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida.

• Secuenciación empleando cebadores fluorescentes

  Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el oligonucleótido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo.

   

• Secuenciación empleando terminadores fluorescentes

  Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.

   

SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS

• Secuenciadores automáticos capilares

Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al sistema basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por un polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la muestra de secuenciación; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos 450pb.

  

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• Secuenciación automática en geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida

La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplará en el secuenciador automático para proceder a la carga de la muestras.

 

EQUIPAMIENTO

Secuenciador automático ABI 377

• Modo operativo: Preparación de las muestras.

   

• Secuenciación de ADN empleando microarrays

  Los microarrays constituyen la última línea de técnicas basadas en la interacción de cadenas complementarias de ADN. Este tipo de técnicas introducen básicamente dos nuevas innovaciones: el empleo de soportes sólidos no porosos tales como cristal que facilitan la miniaturización y la detección basada en fluorescencia y el desarrollo de métodos de síntesis in situ de oligonucleótidos a altas densidades sobre el soporte sólido.

    

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• Pirosecuenciación

  Se trata de un método simple y consistente, útil para la secuenciación de fragmentos de ADN de tamaños pequeños o medianos.

    
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APLICACIONES DE LA SECUENCIACIÓN DE ADN

• Detección de mutaciones
• Secuenciación de ADNs fósiles
• Diagnóstico de enfermedades genéticas
• Identificación de especies y control de cruces entre animales
• Proyecto genoma humano

Detección de mutaciones

Esta técnica nos permite localizar mutaciones previamente descritas. Se emplea así la secuenciación de ADN como un método de diagnóstico: una vez que se ha caracterizado la relación con una enfermedad de una determinada mutación puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa en la galactosemia, mutaciones en c-Ras y cáncer, etc..) o de una pequeña deleción (deleción de 3 bases en el gen CFTR en la fibrosis quística), puede desarrollarse un método de detección rutinario. La secuenciación automática puede emplearse como método de screenig en la localización de nujevas mutacioines.

Secuenciación de ADNs fósiles

El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especímenes de museo y descubrimientos arqueológicos en los cuales la mayoría de las moléculas están dañadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante secuenciación.

Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación

Diagnóstico de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in vitro.

Identificación de especies y control de cruces entre animales

Las técnicas para identificar especies pueden ser muy importantes para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro. Estos estudios pueden realizarse utilizando el ADN mitocondrial, el cual presenta secuencias altamente variables entre especies distintas, aunque sean cercanas entre sí, y bastante conservadas dentro de la misma especie.

Los controles de relaciones parentales en animales tiene importancia forense para el control de comercio ilegal de especies protegidas. Individuos jóvenes de especies en peligro son sacados de sus lugares de nacimiento y "disfrazados" por certificados veterinarios falsos. En estos caso, el estudio familiar es el único medio de descubrir el origen ilegal de los individuos.

Proyecto Genoma Humano

El Proyecto Genoma Humano es un proyecto internacional cuyo objetivo final es obtener una descripción completa del genoma humano a través de la secuenciación del ADN. El genoma que se investiga es el genoma nuclear.

Desde su inicio, el proyecto ha sido justificado especialmente por los beneficios médicos que se espera obtener del conocimiento de la estructura de cada gen humano. Esta información proporcionará una capacidad de diagnóstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad. También se espera que aporte un marco de trabajo para el desarrollo de nuevas terapias, además de nuevas estrategias para la terapia génica.

BIBLIOGRAFÍA

BÁSICA

• Genes VI. Lewin, B. 1997. Oxford University Press, N. .Y.
• Guide to Molecular Cloning. Methods in enzimology 152. Berger, S. L. Y Kimmel, A. K. 1987
• Molecular Cloning. A laboratoty manual. Sambrook. Fritsch. Maniatis. 1989

AVANZADA

• Nucleic Acids secuencing: a practical approach. Bishop, M. J. Computing, pp 185-219, IRL Press, Oxford University Press.
• Nucleic Acids Sequencing: a practical Approach. C. J. Howe and E. S. Ward. IRL Press. Oxford University. 1989
• Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Itakura, K, Rossi, J. J. Y Wallace R. B. 1984. Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356
• The Internet and The new biology. Tools for genomic and molecular approach. Peruski, L. F. Jr. Y Peruski, A. H. 1997. American Society for Microbiology, Washington D. C.