Otros métodos de secuenciación automática
PIROSECUENCIACIÓN
Etapas del proceso:
- Un cebador específico se une a una cadena de ADN sencilla en presencia de dNTPS, ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa así como de los sustratos APS (adenosina 5 fosfosulfato) y luciferina.
- El primero de los cuatro dNTPs se añade a la reacción. La ADN polimerasa cataliza su incorporación a la cadena; si este dNTP es complementario de la secuencia del ADN molde se libera PPi en una cantidad equimolar a la cantidad de nucleótido incorporado.
- La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente el Ppi en ATP en presencia de APS. Este ATP media la conversión de luciferina en oxiluciferina por parte de la luciferasa, produciéndose luz visible en intensidad proporcional a la cantidad de ATP. Esta luz es detectada por una cámara CCD y se visualiza en el pirograma como un pico, siendo la altura del pico proporcional al número de nucleótidos incorporados.
- La apirasa degrada de forma contínua tanto el ATP como los dNTPs no incorporados apagando de esta forma la emisión de luz y regenerando las condiciones para que pueda ser añadido un nuevo nucleótido en la reacción.
- La adición de nucleótidos ocurre de uno en uno. Se sustituye el dATP por dATPalfaS porque este sustrato es reconocido eficientemente por la ADN polimerasa pero no por la luciferasa.
