Secuenciadores automáticos en geles / Equipamiento

SECUENCIADOR ABI 377

Secuenciador automático ABI 377
- PE Biosystems -

El secuenciador automático ABI Prism 377 es un sistema de electroforesis y detección de fluorescencia controlado por microprocesador que se utiliza para secuenciación automática o análisis de fragmentos empleando el método de secuenciación automática en geles desnaturalizantes.

A: Casete. B: Tapa cubeta superior. C: Barra protectora del laser D: Cubeta superior E: Pinzas F Y G: Cubeta inferior H: Dispositivo de carga

El sistema de secuenciación automática se compone de:

• Carga: Cassette del gel. Sistema de inyección.
• Cámara para el cassette en el secuenciador.
• Cristales del secuenciador, espaciadores y peines.
• Separación: Fuente de electroforesis, cubetas, electrodos.
• Sistema de control de temperatura: placa calefactora, bomba, sensores.
• Detección: Laser de Argón. Cámara CCD.
• Control: Ordenador Macintosh.

Principio de funcionamiento

Método de exploración por laser

Codificación cromática de las bandas de electroforésis

Durante la electroforesis las muestras pasan por delante de un haz de luz UV procedente de un laser de argón. La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN, correspondiente a la emisión de fluorescencia del nucleótido incorporado en 3´(para secuenciación automática empleando terminadores fluorescentes), es recogida por una cámara CCD, encargándose el software del equipo de asignar a la fluorescencia emitida la base correspondiente.

Recogida de datos

• Colocar el secuenciador, el casete con el gel y cargar en los pocillos del mismo las muestras.de ADN a secuenciar.

• Aplicar el voltaje necesario para desarrollar la electroforesis de forma que dichos fragmentos migren y se separen en función de su tamaño.

• Cuando al migrar los fragmentos alcanzan la zona de lectura, el haz del láser, que se está desplazando horizontalmente de forma contínua a lo largo del cristal, excita los fluoroforos. La luz emitida se proyecta hacia un espectrógrafo, dotado de una cámara CCD, donde se separa cromáticamente.

• El software del sistema contiene información sobre los fluoroforos que se están utilizando, y sus longitudes de onda y proporciona los filtros adecuados para recoger las intensidades de luz que llegan a la cámara CCD.

• La pantalla del ordenador visualiza, en tiempo real, la información que se recibe desde el secuenciador ABI Prism 377.
  
  Cromatograma
  En el secuenciador ABI 377se pueden leer unas setecientas bases, en la imagen unas cuarenta. Aparecen los picos de colores y en la parte superior de estos la base con la que se corresponden.

Procesado de los datos

• Finalizada la fase de lectura, antes de ser analizados, a los datos se les aplica un filtro matemático que corrige cualquier solapamiento de los espectros de emisión ya que, aunque los terminadores presentan máximos de emisión a difererentes longitudes de onda, los espectros se solapan en cierta medida.

• El software utilizado procesa automáticamente los datos recogidos en una secuencia de bases, los analiza y los visualiza en el monitor.

  
  Gel de secuencia: cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada una de las bandas de colores con una de las bases del ADN . El ordenador identifica color con base y dibuja un cromatograma con los picos de colores y su correspondiente base