Secuenciador automático en geles ABI 377

Secuenciación con terminadores fluorescentes

• Introducir en un tubo de PCR la muestra de ADN de doble cadena, el primer a utilizar y la mezcla de reacción

• Programar la reacción de PCR (multiplicación del ADN) sometiendo la mezcla anterior a 25 ciclos de las siguientes características: 30s a 94ºC (desnaturalización), 15s a 45ºC (anillamiento) y 4min. a 60ºC (elongación).

• Enfriar el tubo a 4ºC

• Purificar el resultado de la reacción de secuencia de PCR, en una solución de etanol y cloruro magnésico: dejar precipitar la mezcla, centrifugar y eliminar por aspiración el etanol.

• Resuspender el resultado de la reacción de PCR en un pequeño volumen de formamida: azul de dextrano. Desnaturalizar la muestra calentándola durnte 2 min. a 90ºC. Enfriar en hielo.

• Cargar los fragmentos de ADN fluorescentes en el gel de secuencia.

Muestras para secuenciar / Preparación del ADN / Secuenciación PCR