LISIS ALCALINA Y PRECIPITACION CON PEG (POLIETILENGLICOL)
Una de las modificaciones de este método con relación a una lisis alcalina normal consiste en crecer las bacterias en Terrific Broth en lugar de Luria Broth (LB), con lo cual se aumenta de 4 a 8 veces el número de bacterias por ml de cultivo, consiguiéndose mayores rendimientos en la obtención de plásmido.
Otra de las modificaciones, consiste en introducir una precipitación con PEG, con lo cual se enriquece la preparación en ADN superenrrollado, libre de contaminaciones de ADN cromosómico y RNA. De hecho, ADN plasmídico aislado empleando otros protocolos de purificación no ha podido ser secuenciado empleando Taq polimerasa y dideoxi-terminadores fluorescentes.
PROTOCOLO.
1. Incubar los cultivos O/N a 37°C en Terrific Broth con el antibiótico adecuado. El volumen de cultivo en los frascos no debe exceder 1/4 del volumen total, con el fin de conseguir una buena aireación.
2. Centrifugar alícuotas de 1.5 ml durante 1 minuto en una minifuga. El tubo puede rellenarse hasta tres veces sin necesidad de modificar los volúmenes empleados en la lisis y extración del plásmido.
3. Quitar el sobrenadante lo más posible, aspirando con una pasteur.
4. Resuspender el pellet en 200 µl de GTE.
5. Añadir 300 µl de una solución 0.2 N NaOH/ 1% SDS recien preparada. Mezclar el contenido por inversión e incubar en hielo durante 5 minutos.
6. Neutralizar la solución añadiendo 300 µl de AcK 3 M, pH 4.8. Mezclar invirtiendo el tubo. Incubar en hielo 5 minutos.
7. Eliminar los restos celulares centrifugando 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
8. Añadir RNasa (libre de DNasa) hasta una concentración final de 20 µg/ml e incubar a 37°C durante, al menos, 20 minutos.
9. Extraer el sobrenadante dos veces. Para ello añadir en la primera extracción 400 µl de fenol. Mezclar las fases con la mano durante 30 segundos. Centrifugar 5 minutos para separar las fases. Recoger la fase superior. Extraer nuevamente esta fase con 400 µl de cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1). Centrifugar y recoger la fase acuosa.
10. Precipitar e ADN añadiendo un volumen de isopropanol (100%) y centrifugar inmediatamente de 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.
11. Lavar el ADN con 500 µl de Etanol 70%. Secar los pellets.
12. Resuspender el pellet de ADN en 32 µl de agua desionizada, y precipitar nuevamente, añadiendo 8 µl de NaCl 4 M y 40 µl de PEG8000 13%/NaCl 4 M.
13. Mezclar bien. Incubar en hielo durante 20 minutos y centrifugar 15 minutos a 4°C en una minifuga.
14. Cuidadosamente retirar el sobrenadante. Lavar el pellet con 500 µl de Etanol 70%. Secar el pellet. Resuspender en 20 µl de agua desionizada. Cuantificar en un gel de agarosa.
TERRIFIC BROTH
SOLUCION A:
SOLUCION B:
TERRIFIC BROTH = 100 ml de Solución A + 900 ml de Solución B
IIB - CSIC