Secuenciador ABI 377 / Preparación de las muestras

Las muestras deberán traerse en un tubo de 0.5 ml (tubos de PCR) y contendrán:

ADN (*)

• Doble cadena 1 µg
  
• Cadena sencilla 0.5 µg
  
• Cósmidos 2.3 µg
  
• Fragmento de PCR 50-800 ng dependiendo del tamaño del fragmento

Cebador (**)

• Doble cadena 3.2 pmoles
  
• Cadena sencilla 0.8 pmoles
  
• Fragmento de PCR 3.2 pmoles

dH2O

• hasta 10.5 µl (No utilizar TE)

(*): El ADN debe cuantificarse bien en un gel de agarosa (junto a unos patrones de concentración conocida) y/o por densidad óptica, teniendo en cuenta que:
Abs 260 nm/ Abs 280 nm = 1.7 - 2.0
Abs 230 nm/ Abs 260 nm = 0.3 - 0.6

Un ADN sucio (con proteínas, fenol, sales, etc...) no funcionará bien en la reacción de secuenciación por Taq polimerasa, así que es necesario limpiarlo previamente por re-precipitación; ultracentrifugación, etc...

(**): Esta tabla os ayudará a encontrar la equivalencia entre ng y pmoles para oligos de distintas longitudes:ß

Longitud del cebador           ng de cebador equiv. a 10 pmoles

     15 mer                                  50 ng
     16 mer	                             53 ng
     17 mer	                             57 ng
     18 mer	                             60 ng
     19 mer	                             63 ng
     20 mer	                             67 ng
     24 mer	                             80 ng
     27 mer	                             90 ng
     31 mer	                             103 ng