Los fragmentos de PCR que se van a secuenciar directamente por secuenciación automática con terminadores fluorescentes, necesitan ser purificados con objeto de eliminar los dNTPs y cebadores de la reacción de PCR. La presencia de más de un cebador en la reacción generaría múltiples escaleras solapantes en un gel. De la misma forma, la contaminación con dNTPs afecta el balance de los mismos en la reacción de secuencia.
Para purificar los productos de PCR pueden emplearse los micro-concentradores Centricon- 100 de Amicon, que son columnas de ultracentrifugación que permiten separar los cebadores y dNTPs del producto de PCR que es de mayor tamaño. Este tipo de columnas puede dar problemas para productos de PCR de menos de 125 pb (Ver Centricon- 30).
Otros productos útiles para la purificación de bandas de PCR son:
* QiaquickTM PCR Purification Columns (QIAGEN INC., Chatsworth, CA: Cat No. 28104)
* Precipitación con PEG.
En el caso de existir bandas de amplificación contaminantes en la reacción de PCR, es necesario la extracción previa de la banda en un gel de agarosa de bajo punto de fusión.
También pueden emplearse bolas magnéticas para la purificación del producto de PCR (DynabeadsR M- 280 Streptavidin). Las bolas magnéticas unen ADN biotinilado generado a partir de un oligo biotinilado. La cantidad de producto de PCR recuperado tras la purificación puede cuantificarse por absorción a 260 nm o en un gel de agarosa con patrones de concentración conocidos. Se secuencia por el extremo contrario al del primer- marcado.
PURIFICACION DEL PRODUCTO DE PCR CON COLUMNAS DE CENTRICON-100
1- Ensamblar la columna de Centricon- 100.
2- Cargar 2 ml de dH2O en la columna.
3- Añadir la muestra de PCR.
4- Centrifugar a 3000 g durante 10 minutos.
5- Quitar el recipiente de residuos y colocar el vial para recuperar el ADN.
6- Invertir la columna y centrifugar a 270 g durante 2 minutos. Se recuperaran unos 40- 60 µl de muestra.
7- Diluir hasta 100 µl con dH2O.
PARA SECUENCIACION AUTOMATICA DE PRODUCTOS DE PCR
Para secuenciar en el Servicio un producto de PCR, traer en un tubo de 0.5 ml:
ADN (fragmento de PCR) 50-800 ng dependiendo del tamaño del fragmento de PCR
Cebador 3.2 pmoles
bH2O hasta 10.5 µl
REFERENCIAS (PERKIN ELMER)
Centricon- 30: - Límite de Pm 30000.
- Retiene dsADN mayor de 50 pb y ssADN de 60 nucleótidos o más.
- Ref: N 930- 1381 (24 unidades).
Centricon- 100: - Límite de Pm 100000.
- Retiene dsADN de más de 125 pb y ssADN de 300 nucleótidos o más.
- Ref: N 930- 2119 ( 24 unidades).
IIB - CSIC