LABORATORIO B19                     

Biogénesis mitocondrial en Drosophila melanogaster.

(M.A. Fernández Moreno, C. Adán, P. de la Peña, P. Ochoa, R. Garesse)

 La biogénesis mitocondrial es un proceso básico para la fisiología de la célula que requiere la expresión coordinada de dos genomas localizados en compartimentos física y genéticamente diferentes, el mitocondrial y el nuclear. Ello exige la puesta en marcha de un complejo programa de expresión génica que debe modularse en función de las necesidades energéticas de los diferentes tejidos y responder a un número variado de señales fisiológicas, incluyendo las producidas durante el desarrollo embrionario. A pesar de su importancia central a nivel celular los mecanismos moleculares que regulan la biogénesis de mitocondrias anímales son aún muy mal conocidos. En nuestro grupo estamos utilizando Drosophila melanogaster como sistema modelo con objeto de caracterizar factores de transcripción relevantes para el programa de diferenciación mitocondrial. Mediante la utilización de una combinación de técnicas in vitro e in vivo estamos caracterizando las regiones promotoras de varios genes esenciales para la biogénesis mitocondrial e identificando los factores que regulan su expresión. En colaboración con el grupo de la Dra. Kaguni (MSU) hemos dmostrado que el factor de transcripción DREF, que regula la expresión de genes que participan en la replicación del genoma nuclear en Drosophila es también esencial para la expresión de dos genes de la maquinaria de replicación del mtDNA, la proteína de unión a DNA de cadena sencilla y la subunidad accesoria de la DNA polimerasa mitocondrial, estableciendo por primera vez un nexo de unión entre las replicaciones de los DNAs mitocondrial y nuclear durante el ciclo celular. Actualmente estamos caracterizando las regiones promotoras de diversos genes que codifican factores de las maquinarias de replicación y transcripción mitocondrial: helicasa, mtTFA, mtTFB y RNA polimerasa.

Caracterización molecular de enfermedades neurodegenerativas de origen mitocondrial.

(B. Bornstein, M.A. Fernández Moreno, R. Garesse)

 En consonancia con su función central en el metabolismo y homeostasis celular, las mutaciones en genes mitocondriales, codificados tanto en el núcleo como en la mitocondria, provocan un amplio espectro de patologías, usualmente con un fenotipo devastador. Las enfermedades mitocondriales, fundamentalmente alteraciones en la función  OXPHOS, se asocian a un amplio espectro de manifestaciones clínicas, mayoritariamente disfunciones neurológicas degenerativas, que incluyen cegera, sordera, demencia, trastornos del movimiento, ataxia, corea y encefalopatías. Los defectos mitocondriales se asocian también con debilidad muscular, fallo cardíaco, diabetes, disfunciones renales, enfermedad hepática, etc. Se trata por tanto de un grupo de enfermedades multisistémicas, difíciles de diagnosticar y tratar, y de una gran relevancia socio-sanitaria. Aunque su diversidad clínica y genética hace difícil determinar su incidencia exacta en la población, se estima que es relativamente elevada. Sólo las alteraciones de la función OXPHOS causadas por mutaciones conocidas en el mtDNA afectan al menos a uno de cada 8500 habitantes. Uno de los principales problemas que tiene planteado el campo de la patología mitocondrial es que no existe una correlación clara entre genotipo (mutación) y fenotipo (patología que origina). Por otro lado, la alta velocidad de mutación del mtDNA está originando que se describan una serie de mutaciones asociadas a diferentes enfermedades que sólo constituyen polimorfismos presentes en la población. En colaboración con el grupo del Dr.  Joaquín Arenas (Hospital 12 de Octubre, Madrid) estamos interesados en la identificación de nuevas mutaciones y en el estudio molecular de las mismas. Para ello estamos utilizando diferentes líneas celulares a las que hemos eliminado su mtDNA (r0), con mitocondrias de fibroblastos de pacientes con enfermedad mitocondrial, y realizando un estudio bioquímico y molecular de las alteraciones que provoca la mutación. La disponibilidad a medio plazo de un banco de líneas celulares portadoras de distintas variantes patogénicas del mtDNA en combinación con distintos genomas nucleares, permitirá un análisis de la respuesta del sistema OXPHOS al tratamiento con distintos fármacos, dependiendo de la mutación y del contexto nuclear. Un segundo objetivo dentro de esta línea de investigación es la identificación de genes nucleares responsables del síndrome de depleción mitocondrial. Estamos estudiando 15 casos, y de los genes descritos actualmente sólo uno de ellos tiene una mutación en el gen que codifica la timidina kinasa, lo que indica la heterogenicidad genética de la enfermedad.

Drosophila melanogaster como modelo de patología mitocondrial.

F. Martínez Azorín, R. Garesse)

La falta de modelos animales adecuados es otro de los retos importantes que tiene planteado actualmente el campo de la patología mitocondrial. Una tercera línea de trabajo de nuestro grupo está dirigida a generar líneas de Drosophila que manifiesten un fenotipo de disfunción mitocondrial. Para ello estamos utilizando dos estrategias diferentes: i) manipular el sistema de replicación del mtDNA sobreexpresando in vivo versiones normales (silvestres) y mutadas de la subunidad catalítica de la DNA polimerasa mitocondrial, tanto de un modo constitutivo como en tejidos específicos; ii) generar moscas transgénicas en las que se sustituyan genes silvestres que codifiquen factores de la maquinaria de replicación mitocondrial, por las versiones de los mismos que contengan mutaciones específicas detectadas en patología humana. Actualmente disponemos de las condiciones experimentales adecuadas para generar una depleción de mtDNA. Así mismo, hemos generado líneas transgénicas que acumulan mutaciones en el mtDNA, ya que hemos eliminado la actividad correctora de la subunidad catalítica de la DNA polimerasa g, y estamos estudiando el posible efecto que provoca en el proceso de envejecimiento. Hemos comenzado a generar las versiones mutantes del gen polg-a y mthelicasa con diferentes mutaciones identificadas en patología humana, con objeto de sustituir in vivo el gen silvestre por el mutado. Una vez generadas las moscas transgénicas realizaremos un estudio de las alteraciones que provocan en el proceso de biogénesis mitocondrial, centrándonos más específicamente en los procesos de neurogénesis y biogénesis. Por oro lado, a medio plazo aplicaremos una estrategia genética, ya utilizada por otros grupos, que nos permita identificar genes que modulen el fenotipo in vivo.