Memoria Científica 1998-99

Laboratorio de Pilar Santisteban Sanz

Transducción de señales y mecanismos transcripcionales implicados en el control del crecimiento y la diferenciación celular: Papel de factores de transcripción específicos de tejido.

Investigador Principal:	Santisteban, Pilar, Investigador Científico
Investigadores Contratados:	Velasco, Juan Angel (hasta septiembre 98)
Personal de Apoyo:	Seisdedos, Maria Teresa
Becarios Postdoctorales:	García, Bibian
	Barroso, Isabel (desde octubre 1999)
Becarios Predoctorales:	Ortiz, Lourdes (hasta Abril 1998)
	Barroso, Isabel (hasta octubre 1999)
	Medina, Diego L.
	Losada, Alejandro
	Dilla, Tatiana
	Rivas, Marcos (desde Mayo 1998)
	Cuesta, Isabel (desde Septiembre 1998)
Colaboraciones:	Di Lauro, Roberto (Stazione Zoologica A. Dohrn, Nápoles, Italia)
	Cato, Andrew (Genetiik Institut, Forschungszentrum Karlsruhe, Alemania)
	Tobar, Juan A (Servicio Cirugía Pediátrica, Hospital La Paz, Madrid)

Palabras Clave

Expresión génica, Transducción de señales, Transcripción, Diferenciación, Ciclo celular. Cancer.

Regulación hormonal de la expresión de genes específicos de tiroides:

1) Transportador de Iodo (NIS, Na⁺/I^- Symporter)

(B. García y P. Santisteban)

Tres de los genes específicos de tiroides y marcadores del fenotipo tiroideo diferenciado son los genes Tiroglobulina (Tg), Tiroperoxidasa (TPO) y el tranpostador de Iodo (NIS). Los tres genes son decisivos en la síntesis de las hormonas tiroideas. Estas son hormonas iodadas y por tanto es necesario que exista un riguroso control del gen responsable del transporte de iodo (NIS) al interior de la célula epitelial tiridea. Por ello estamos estudiando la regulación a nivel transcripcional de NIS por los principales ligandos reguladoras de la función tiroidea: la tirotro­pina TSH, la insulina y el IGF-I.TSH aumenta la expresión de NIS, y a diferencia de lo que ocu­rre para Tg y TPO ni insulina ni IGF-I tienen efecto alguno. Sin embargo, ambos ligandos inhiben de una forma dependiente de dosis la expresión de NIS inducida por TSH. El efecto de la TSH es mediado por AMPc ya que es reproducido por forskolina. El inhibidor de PKA, H89, reduce el estimulo de TSH pero tambien a diferencia de lo que ocurre para Tg y TPO no lo anula totalmente. Ello sugiere una regulación dependiente y otra independiente de PKA del gen NIS. Actualmente estamos estudiando la regulación del promotor de NIS. En la región más proximal se ha identificado un elemento de respuesta a TSH pero no a AMPc.En una región dis­tal se ha identificado un enhancer (NUE = Nis Upstream Enhancer) que posee sitios de unión para dos factores de transcripción específicos de tiroides TTF-1 y Pax-8 (que definiremos más adelante) así como una secuencia de respuesta a AMPc (CRE-like). Este elemento NUE res­ponde fuertemente a TSH/AMPc. Nosotros estamos intentando localizar regiones en el pro­motor de NIS que respondan a insulina/IGF-I, y que inhiban la activación transcripcional ejer­cida a traves del elemento NUE por TSH.

2) Papel del factor de transcripción específico fork head TTF-2 y del factor constitutivo CTF/NF-1

(L. Ortiz, M.T. Seisdedos, I. Cuesta y P. Santisteban)

Los promotores de los genes Tg y TPO están muy bien caracterizado. En ambos se unen tanto factores de transcripción específicos de tejidos (TTF-1, TTF-2 y Pax-8) como fac­tores constitutivos (CTF/NF-1). Trabajos previos de nuestro laboratorio habían indicado que el factor de transcripción TTF-2, de la familia fork-head, media la respuesta hormonal de ambos genes. TTF-2 se une a un elemento en cis en ambos promotores al que hemos defini­do como un ele­men­to de respuesta a hormonas. Sin embargo para que el factor TTF-2 sea ac­tivo transcrip­cionalmente necesita interaccionar con otros factores. Por ensayos de inter­acción proteína-pro­teína hemos demostrado que TTF-2 interacciona con el factor constitutivo CTF/NF-1. Así mis­mo mediante estudios de foot-printing genómico hemos podido demos­trar que para que el gen TPO se transcriba es necesaria la interacción estereoespecífica de am­bos factores.

Dado que ambos factores son necesarios para la regulación hormonal tiroidea, nos he­mos centrado en el estudio de su regulación hormonal. Los resultados obtenidos indican que la ex­pre­sión tanto de TTF-2 como de CTF/NF-1 está regulada por TSH, vía AMPc, así co­mo por insulina e IGF-I. Los genes específicos de tiroides Tg y TPO son a su vez antígenos tiroideos que juegan un papel decisivo en procesos de autoinmunidad tiroidea. Estamos estu­dian­do la participación del factor TTF-2 en este proceso, habiendo demostrado que interleu­qui­na-1 (IL-1) y el interferon (IF)-g (factores usados en el tratamiento de pacientes con au­to­inmunidad ti­rodea) disminuyen la expresión del antígeno tiroideo TPO. Este efecto tiene lugar a nivel trans­cripcional ya que en ensayos de transfección transitoria hemos demostrado que la actividad del promotor TPO disminuye tras tratamiento con IFg e IL-1. Lo más intere­sante es que de nuevo el elemento en cis que media la respuesta a IFg e IL-1 es el elemento de unión a TTF-2. Así mis­mo la expresión de este factor de transcripción disminuye tras el tratamiento con IFg e IL-1, in­di­cando su participación directa en los citados proceso de auto­inmunidad tiroidea.

En colaboración con el grupo del Dr. Roberto Di Lauro, se ha caracterizado el promo­tor de TTF-2. Dada la participación decisiva de este factor en la regulación hormonal tiroidea, en nuestro laboratorio estamos identificando los elementos en cis y en trans, en dicho promo­tor que medien las anteriores respuestas a TSH, cAMP, insulina, IGF-I, IFg e IL-1. Así mis­mo estamos estudiando el sistema de traducción de señales implicadas en la anterior regulación.

3) Reordenamiento de cromatina y control transcripcional.

(I. Cuesta y P. Santisteban)

El objetivo principal de este proyecto es el entendimiento de como factores de trans­crip­ción que se unen a secuencias específicas del DNA regulan la estructura de la cromatina, y por lo tanto controlan la capacidad transcripcional de sus genes diana. Este proyecto surge como consecuencia del hecho de que factores de la familia forkhead sean candiadatos a regu­ladores de la estructura altamente ordenada de la cromatina. Estos factores de transcripción tienen simi­laridad estructural con histonas linker, las cuales se unen a nucleosomas y com­pac­tan la cro­ma­tina. Este proyecto se ha iniciado recientemente en nuestro grupo. Los estu­dios que esta­mos realizando tienen como objetivo investigar los mecanismos por los cuales el factor TTF-2, un miembro de la familia forkhead, regula la estructura y la capacidad trans­crip­cional de sub­s­tratos cromatínicos artificiales in vitro. Pretendemos estudiar la homología estructural entre TTF-2 e histonas linker y como TTF-2 es capaz de descompactar estruc­tu­ras cromatínicas. Estudiaremos este procesos en diferentes situaciones experimentales en cé­lu­las tiroideas nor­males y transformadas.

Control de la proliferación celular tiroidea.

1) Transducción de señales y ciclo celular en células epiteliales tiroideas.

(D.L. Medina y P. Santisteban)

El tiroides está compuesto de dos tipos celulares bien diferenciados: células epiteliales (o foliculares), que expresan Tg, TPO y NIS y células parafoliculaes que expresan calcitonina.

Las células epiteliales son el componente mayoritario y su proliferación está regulada prin­cipalmente por la hormona TSH, que en estas células está considerada como un factor de cre­cimiento. Recientemente hemos descrito la existencia de un bucle de regulación autocrina en cé­lulas epiteliales tiroideas de rata FRTL-5, en el que participan la TSH y el inhibidor ge­ne­ral de la proliferación somatostatina (SS). Profundizando en los mecanismos implicados en este proce­so hemos demostrado que la TSH disminuye los niveles del inhibidor de quina­sa dependientes de ciclina p27^kip1 , aumenta la expresión del 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA-Red), el enzima limitante en la síntesis de colesterol y derivados iso­pre­noides, y aumenta la traslocación a la membrana de la proteína GTPasa RhoA. En cuanto a los genes importantes en la progresión a través del ciclo celular, la TSH incrementa los ni­ve­les de la ciclinas típicas de la fase G1 (D1 Y E), así como los niveles de la quinasas de­pen­diente de ciclina CDK2. Es­tos incrementos se complementan con un aumento de la for­mación de los complejos ciclina E-CDK2 activos.

Por el contrario la SS inhibe la disminución de p27^kip1 , mediada por la TSH, y disminuye la for­mación de complejos ciclina E-CDK2 activos. Utilizando inhibidores específicos de las dis­tintas vías de señalización, y/o dominantes negativos de las diferentes quinasas impli­ca­das, he­mos podido demostrar que la proliferación de células epiteliales tiroideas mediada por TSH se produce a través de al menos dos vías en las que participan la PKA y la PI3K. Am­bas rutas ac­tivan la síntesis de isoprenoides, necesarios para la traslocación de RhoA a la mem­brana plas­má­tica. Al mismo tiempo, TSH incrementa la expresión de ciclinas esenciales para la transición G1/S y de la CDK2. La SS bloquea estos efectos mucho más arriba de la ac­tivación de las vías de la PKA y la PI3K, inactivando la adenilato ciclasa.

2) Control del ciclo celular en células parafoliculares tiroideas

(T. Dilla, J.A. Velasco, Medina D.L. y P. Santisteban)

En este estudio estamos utilizando un modelo de células parafoliculares derivadas de un carcinoma medular de tiroides (células MTT). Datos previos de nuestro laboratorio habían de­mos­trado que esta células son deficientes en p53. Basados en las observaciones de que la onco­proteína MDM2 inhibe la parada del ciclo celular y la apoptosis inducida por p53 y que induce el ciclo celular en ausencia de p53, nos propusimos estudiar el papel de MDM2 en las células MTT. En primer lugar comprobamos que el oncogen mdm2 está ausente en dichas células y me­diante transfección estable generamos lineas de células MTT expresando MDM2. Las lineas ge­ne­radas presentaron un retardo en el crecimiento, demostrándose por citometría de flujo una po­blación de células en estado hipodiploide lo que sugería una nueva función para MDM2 co­mo inductor de apoptosis. Esta circunstancia se ha demostrado en más detalle mediante marcaje con anexina V y formación de la escalera de DNA. Comprobamos también, mediante inyección de las célula generadas en ratones desnudos, que MDM2 no revierte el fenotipo tumoral, aunque cuando analizamos el porcentaje de células apoptótica en los tumores con la técnica de TUNEL el número de núcleos apoptóticos era 20 veces superior en los tumores que sobreexpresaban MDM2. En la búsqueda de posibles rutas implicadas en la apoptosis mediada por MDM2 hemos demostrado que produce una disminución de los niveles de la proteína antiapoptótica bcl-2 y un aumento en los de caspasa 2. Actualmente continuamos caracterizado otras proteínas implicadas en la respuesta apoptótica inducida por MDM2 en las células MTT, asi como la implicación de es­ta oncoproteína en carcinomas medulares tiroideos humanos.

Regulación de la expresión de genes específicos de pulmon:

1) Expresión de las proteínas surfactante de pulmón y del factor de transcripción homeotico TTF-1: Papel de glucocorticoides y antioxidantes

(A., Losada, J.A. Tovar y P. Santisteban)

El factor de transcripción homeótico TTF-1, identificado inicialmente en tiroides, se ex­pre­sa también en pulmón y se ha definido como un factor esencial tanto para el desarrollo mor­fo­lógico de éste órgano como para su maduración bioquímica ya que regula la expresión de las proteínas surfactantes de pulmón. Utilizando un modelo animal de hipoplasia pulmonar, indu­cida por el herbicida nitrofen, hemos demostrado la existencia de una marcada disminución de la expresión de TTF-1. Esta disminución es paralela a la de la expresión de la proteína B del sur­fac­tante pulmonar. Además hemos conseguido revertir la disminución de la expresión tanto de TTF-1 como de SP-B al tratar con glucocorticoides a los animales que sufren hipoplasia pulmo­nar. Por otro lado y teniendo en cuenta la mejora en el desarrollo pulmonar que sufren estos ani­males cuando se les administra antioxidantes como vitamina E, hemos estudiado la posible regu­lación redox que el nitrofen ejerce sobre TTF-1, llegando a la conclusión de que este compuesto actúa como un oxidante en ensayos in vitro, oxidando TTF-1 e impidiendo en parte la unión de este factor de transcripción a sus elementos en cis en el promotor de SP-B. En cuanto al meca­nis­mo de acción de los corticoides estamos estudiando en nuestro modelo la implicación del com­plejo AP-1 y de la inhibición de su activación por corticoides.

2) Expresión diferencial de TTF-1 en pulmón y en tiroides.

(M. Rivas y P. Santisteban)

Como hemos venido exponiendo a lo largo de esta memoria, el factor homeótico TTF-1 se expresa en dos órganos diferentes, el tiroides y el pulmón. La pregunta que surge es: ¿Como un factor de transcripción específico de tejido tiroideo, controla la expresión de proteínas especí­fi­cas de otro tejido (el pulmonar) que no expresa ningún fenotipo tiroideo? Para resolver esta pre­gunta hemos iniciado recientemente un proyecto nuevo en el que el primer objetivo que nos he­mos planteados es estudiar el papel de TTF-1 en la regulación de los promotores de Tg y de SP-B. En una primera aproximación estamos estudiando si en células pulmonares (H441) que con­tie­nen TTF-1 somos capaces de expresar exogenamente el promotor de Tg y viceversa: si en cé­lulas tiroideas (FRTL-5) que también expresan TTF-1 somos capaces de expresar el promo­tor de SP-B. Estos resultados nos indicarían si el problema de la expresión diferencial de ambos genes (Tg y SP-B) es la abundancia relativa de TTF-1 en ambos tejidos. Otro problema que es­tamos abordando es si la expresión diferencial es debida a un problema de metilación de los pro­motores Tg y SP-B en los dos tejidos (pulmón y tiroides). Finalmente otra de las hipótesis que barajamos es la existencia de proteínas nucleares (co-activadoras o co-represoras) que interac­cionen con TTF-1 y que se expresen de forma diferencial en ambos tejidos. 

Factores de transcripción y vías de transducción de señales implicados en la regulación del gen del énzima málico citosólico.

(I. Barroso, M.T. Seisdedos y P. Santisteban)

La expresión del gen del enzima málico citosólico (ME) está regulada hormonalmente. En este trabajo nos hemos centrado en un estudio en profundidad del control transcripcional de ME por insulina en células de hepatoma de rata H35. Mediante ensayos de transfección transitoria hemos localizado el elemento de respuesta a insulina el promotor de ME. Por ensayos de retardo en gel hemos demostrado que Sp1 y Sp3 se unen a ese elemento de manera constitutiva. El tra­ta­miento con insulina induce la unión rápida y transitoria del factor de repuesta temprano Egr-1, el cual desplaza a Sp1 de su sitio de unión al DNA. La inducción de Egr-1 depende de la estimu­lación de la ruta Ras/MAPK e inhibe el promotor de ME, lo que podría formar parte de una res­puesta mitogénica de las células a la insulina. En una fase más tardía la hormona induce la trans­cripción del gen, mediante la activación de una ruta distinta que depende de PI3-K. En ésta res­puesta tardía podría participar Sp1. La funcionalidad de Sp1 la hemos estudiado en ensayo de transfección transitoria usando como modelo células de Drosophila SL-2 (que no expresan éste factor). Actualmente estamos estudiando en detalle la cooperación de Sp1 con miembros de la su­perfamilia de receptores nucleares que también regulan el promotor de ME.

Finalmente hemos estudiado el control de la expresión de ME por hexaclorobenceno (HCB), un compuesto que actúa a través del receptor de dioxinas. Hemos demostrado que la transcripción de ME está bajo el control de HCB, habiendo delimitado en el promotor ME un elemento de respuesta a xenobióticos (XRE). Lo más interesante es que el elemento XRE coin­cide con un elemento de respuesta a hormonas tiroideas (TRE) previamente definido en dicho promotor. El HCB induce una proteína nuclear que se une al elemento XRE/TRE, cuyas propie­dades de unión al DNA son similares a las de los receptores nucleares pero cuya identidad nos es aún desconocida.

Publicaciones

Cruz, F., Scott, S. R. , Barroso, I., Santisteban, P. and Cerdan, S. (1998) Ontogeny and cellular location of the pyruvate recycling system of rat brain. J. of Neurochemistry 70, 2613-2619

Velasco, J.A., Acebrón, A, Zannini, ME., Martín-Pérez, J., Di Lauro, R. and Santisteban, P. (1988) Ha-ras interference with thyroid cell differentiation is associated with a down-regulation of TTF-1 phosphorylation. Endocrinology, 139, 2796-2802

Moreno, J.C. and Santisteban, P. (1998) Contribución de la investigación básica a la práctica de la endocrinología. Endocrinología 45, 41-43

Santisteban, P. (1999) Biología molecular del tiroides. En: Actualizaciones en Endocrinología: Tiroides (Dieguez, C., Pavia, C., Yturriaga R., eds). McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, pp 73-93

Moreno, J.C. (1999) Bocios disenzimáticos. En: Actualizaciones en Endocrinología: Tiroides (Dieguez, C., Pavia, C., Yturriaga R., eds). McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, pp 209-233.

Medina, D.L., Velasco, J.A. and Santisteban, P. (1999) Somatostatin is Expressed in FRTL-5 cells and prevents TSH-mediated down-regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27^kip1. Endocrinology 140, 87-95

Ros, P., Rossi, D., Acebrón A. and Santisteban, P. (1999) Thyroid-specific gene expression in the multi-step process of thyroid carcinogenesis. Biochimie 81, 389-396

Losada, A., Xia, H., Migliazza, L., Diez-Pardo, J.A., Santisteban, P., and Tovar, J.A. (1999) Lung hypoplasia caused by nitrofen is mediated by down-regulation of the transcription factor TTF-1. Pediatric Surg. Int. 15, 188-191

Ortiz, L., Aza-Blanc, P., Zannini, M., Cato A.B. and Santisteban, P. (1999) The interaction between the forkhead thyroid transcription factor TTF-2 and the constitutive factor CTF/NF1 is requiered for an efficient hormonal regulation of thyroperoxidase gene expression. J. Biol. Chem. 274, 15213-15221

Barroso I., and Santisteban, P. (1999) Insulin-induced early growth response gene (Erg-1 ) mediates a short term repression of rat malic enzyme gene transcription. J. Biol. Chem. 274, 17997-18004

Barroso, I., Benito, B., García-Jiménez, C., Hernández, A., Obregón. M-J. and Santisteban, P. (1999) Norepinephrine, triiodothyronine and insulin up-regulate glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase gene during brown adipocyte differentiation. Eur J Endocrinology 141, 169-179

Loaiza-Pérez, A., Kleiman de Pisarev, D., Seisdedos, M. T., Randi, A., Ferramola, A.M., Sancovich, H and Santisteban, P. (1999) Hexachlorobencene, a dioxin-type compound, increase malic enzyme gene transcription through a mechanism involving the thyroid hormone response element. Endocrinology 140, 4142-4151

Tesis doctorales

Lourdes Ortiz

“Interacción del factor fork head TTF-2 con factores constitutivos CTF/NF-1 en el con­trol hormonal de la transcripción del gen de peroxidasa tiroidea”. Universidad Au­tónoma de Madrid. Facultad de Ciencia Químicas. 1998. Directora: Pilar Santisteban. Ca­lifica­ción: Sobresaliente "cum laude"

Andrea Loaiza

“Estudios del mecanismo molecular de acción del hexaclorobenceno sobre la expresion del gen de la enzima málica citosólica hepática”. Universidad de Buenos Aires (Argen­tina). Fa­cultad de Ciencia Exactas y Naturales. 1998. Directora: Pilar Santisteban. Co-directo­res: Horacio A. Sancovich y Diana L. Kleiman. Calificación: Sobresaliente

Isabel Barroso

“Caracterización de los elementos en cis y en trans que median la regulación por insu­lina del gen del enzima málico citosólico”. Universidad Complutense de Madrid. Fa­cultad de Farmacia. 1999. Directora: Pilar Santisteban. Calificación: Sobresaliente "cum laude"