Memoria Científica 1998-99

Laboratorio de Juan José Aragón Reyes

Bases estructurales del control, expresión e interacción con la formación de microtúbulos de fosfofructokinasas eucarióticas. Evaluación in vivo de lactasa intestinal mediante galactosil-xilosas.

Investigador Principal:	Aragón, Juan J., Catedrático UAM
Personal de Apoyo:	Sánchez, Valentina
Becarios Postdoctorales:	Martínez-Costa, Oscar
Becarios Predoctorales:	Santamaría, Mª Belén
	Hermida, Carmen
	Sanchez, Cristina (hasta Enero 1999)
Colaboraciones:	Avila, Jesús, Centro de Biología Molecular CSIC-UAM
	Escalante, Ricardo, IIB-AS
	Fernández- Mayoralas, A. , Instituto de Química Orgánica CSIC, Madrid
	Heinisch, Jürgen J. , Institut für Mikrobiologie, Heinrich-Heine- Universität Düsseldorf, Alemania.

Palabras clave

Fosfofructokinasa, lactasa intestinal, tubulina, relación estructura/función, Dictyostelium discoideum , células tumorales

Análisis estructural del control y expresión de la fosfofructokinasa de células eucarióticas.

(M.B. Santamaría, C. Sánchez, O. Martínez-Costa, V. Sánchez y J.J. Aragón)

Esta línea se dirige al análisis de los motivos estructurales implicados en la catálisis y la regulación de la fosfofructokinasa (PFK), enzima clave para el metabolismo de carbohidratos, y al estudio del control de la expresión del isozima C en células tumorales. La construcción de dos PFKs quiméricas mediante el intercambio de las mitades N- y C-terminales de los isozimas M de músculo y C de tumor ascítico, que tienen características reguladoras diferentes, nos ha per­mi­tido evaluar la contribución de cada uno de estos dominios al centro activo y a los sitios de ligamiento de varios efectores alostéricos. A través de delecciones y mutaciones seriadas, he­mos caracterizado en detalle una región del enzima no regulador de Dictyostelium discoideum responsable de su falta de control alostérico. El comportamiento de mutantes en dicha región, las diferencias estructura/función entre los isozimas C y M y la conducta de las PFKs quimé­ri­cas han señalado el interés potencial de determinados residuos cuya implicación en la union de ligantes específicos estamos examinando por análisis mutacional. La obtención en el laboratorio de cada uno de estos isozimas como proteínas recombinantes en cantidades importantes hace ade­más accesible su cristalización, de interés capital para esta línea al no haberse resuelto aún la estructura tridimensional de ninguna PFK eucariótica. Por otra parte, a la vista del elevado con­te­nido en isozima C de las células tumorales, en las que su expresión esta sometida a control a largo plazo durante el desarrollo del tumor, estamos tratando de aislar y caracterizar la región pro­motora de este gen y pretendemos estudiar la relación de su expresión con el proceso de di­ferenciación celular.

Interacción de la fosfofructokinasa de D. discoideum con la formación de microtúbulos.

(M.B. Santamaría, O. Martínez-Costa, V. Sánchez y J.J. Aragón)

Tras haber identificado este enzima como un potente inhibidor específico de la polime­ri­zación de tubulina, hemos evidenciado la formación de complejos tubulina-PFK y estamos tra­tando ahora de examinar, por un lado, el posible papel in vivo de este efecto (enteramente dife­rente de la función catalítica de este enzima) mediante anulación y sobreexpresión del gen pfk en D. discoideum (en colaboración con el Dr. R. Escalante) y transfección y/o microinyección de la proteína en células animales (en colaboración con el grupo del Dr. J. Avila del Centro de Biología Molecular) y, por otro, de caracterizar a nivel molecular la interacción del inhibidor con tubulina.

Empleo de galactosil-xilosas para la evaluación in vivo de lactasa intestinal co­mo posible método diagnóstico de la deficiencia de este enzima.

(C. Hermida y J.J. Aragón)

La administración oral de 4-galactosil-xilosa a ratas lactantes conduce a la eliminación en orina de la xilosa resultante de su hidrólisis por la lactasa intestinal, donde puede ser determina­da mediante un simple ensayo colorimétrico. La fuerte correlación existente entre la xilosa ex­cre­tada y los niveles de lactasa intestinal a lo largo del desarrollo de los animales, junto con el re­lativamente simple proceso de síntesis del disacárido (desarrollado por el grupo del Dr. A. Fer­nández-Mayoralas), lo reducido de la dosis necesaria del mismo y la sencillez de la valora­ción de xilosa (compuesto por otra parte fisiológico), nos ha llevado a proponer esta sistemática como método de diagnóstico no invasivo de la deficiencia de lactasa y en general de la integri­dad funcional de la mucosa intestinal, con interés particular en pediatría. Hemos examinado la efi­cacia de 4-galactosil-xilosa frente a los regioisómeros 3- y 2-galactosil-xilosa (productos co­la­terales de la síntesis), resultando ser el primero el más idóneo para la evaluación in vivo de la actividad del enzima a pesar de que la lactasa muestra una eficacia catalítica in vitro muy supe­rior para los otros dos compuestos. Actualmente estamos optimizando la evaluación in vivo del enzima a través de los niveles en sangre de xilosa, procedimiento alternativo mínimamente cruen­to que puede ser de gran valor práctico en sujetos lactantes. En colaboración con la indus­tria farmacéutica se esta llevando a cabo la síntesis a mayor escala del disacárido con vistas al inicio de ensayos clínicos en fase I.

Publicaciones

Orosz, F., Santamaría, B., Ovádi, J., and Aragón, J.J. (1999) Phosphofructokinase from Dictyostelium discoideum is a potent inhibitor of tubulin polymerization. Biochemistry 38, 1857-1865.

Tesis Doctorales

Cristina Sánchez Martínez

"La fosfofructokinasa C de tumor ascítico de Ehrlich: estructura, expresión y manipula­ción genética". Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias. 1999. Director: Juan J. Aragón. Calificación: Sobresaliente "cum laude".